梯度洗脫（gradient elution）是液相色譜中通過隨時間改變流動相組成（通常是有機相比例）來優化分離的一種常用技術。下面給出要點、設計原則、常用參數、注意事項與常見問題與解決辦法，便于實際應用與優化。

基本概念與目的

定義：在一次色譜運行中按程序改變流動相中有機溶劑（或另一組分）比例，從弱洗脫（保留強）逐步變為強洗脫（促進強保留組分洗脫）。

目的：在單次運行中高效分離極性差異大的組分、縮短保留時間、提高峰容量并改善峰形，適合復雜樣品和寬極性范圍分析。

常用梯度類型

線性梯度（最常用）：有機相比例隨時間線性增加或減少。

等度-階躍梯度（step）：保持一段時間后快速跳變，適用于目標峰集中在某區段。

多段梯度：組合幾個線性/階躍段優化復雜樣品的分段分離。

關鍵參數與設計原則

起始與終止條件（%B初始，%B終止）：決定短保留和長保留組分的洗脫窗。常見：小分子反相從5–10% B到95% B；肽類常用2–40% ACN。

梯度時間（tG）：從起始到終止所用時間。短梯度適用于快速篩樣，長梯度提高分辨率。

梯度斜率（steepness）：Δ%B / tG（％/min），也與柱體積和流速相關。一般斜率太陡分離差，太緩時間長。

流速（F）與柱體積（Vm）：不同柱規格需按柱體積/流速調整梯度（保持相似的梯度“強度”）。常用做法：梯度時間與柱體積成比例縮放。

沖洗段（high %B）與再平衡（re-equilibration）：結束后通常用高有機沖洗去除強保留物，再回到初始條件并保持足夠時間使柱平衡（至少數個柱體積，經驗值10柱體積或2–5分鐘視柱而定）。

計算與縮放實用公式

梯度速率 = Δ%B / tG（%/min）。

梯度延遲體積（dwell volume或gradient delay）會導致儀器上報告的梯度開始時間與柱實際接收到的時間不同：Vdelay = F × tdelay。需在方法中校正或在不同系統間遷移方法時考慮。

若要在不同柱徑/長度或流速之間等效縮放：保持梯度按“柱體積單位”比例縮放（tG_new ≈ tG_ref × (Vm_new / Vm_ref) × (F_ref / F_new)）。

（Vm ≈ π r^2 L ε，ε為柱孔隙率）

常見實踐建議（數字化）

初始%B常設為樣品中最早洗脫的組分略低于可洗脫的最低有機含量（如5–10%）。

對小分子混合物：常用5–95% B / 10–30 min。

對肽或蛋白消化產物：常用2–40% ACN / 30–120 min以提高分辨率。

沖洗：在終點保持1–3 min高%B（或更長）以洗出強保留或脂類污染。

再平衡：至少10柱體積或方法中設定與起始條件等效的等待時間（UHPLC建議更嚴格）。

儀器與流動相注意事項

梯度泵和混合器需工作良好以保證比例準確性；小流量系統對延遲體積敏感。

使用可混溶、低吸光的溶劑和透明緩沖體系（LC–MS用揮發性鹽如甲酸/乙酸/氨水），避免非揮發性鹽造成柱與MS污染。

溶劑需脫氣、過濾以避免氣泡與噪音。

對檢測器（如ELSD/RI）梯度會帶來基線漂移或基線變化，選擇適當檢測器或用參考/基線校正。

LC–MS 特別注意

使用揮發性緩沖（甲酸、乙酸、甲酸銨等），避免三甲胺或磷酸鹽等非揮發性組分。

梯度初始高水相（低有機）會在ESI中造成霧化/信號變化，注意起始溶劑強度與離子化效率的兼容。

在樣品流入MS之前可將前段廢液棄掉（divert valve），僅在目標洗脫窗口傳送到MS以減少污染。

常見問題與排查

峰拖尾或峰形變差：檢查起始/終止溶劑強度、進樣溶劑與起始流動相是否不相容、柱污染或柱溫問題。

基線漂移：溶劑吸光、緩沖鹽溶度變化、脫氣不充分或泵混合不均。

峰丟失或提前：梯度延遲體積或進樣溶劑造成的溶媒效果；確認系統dwell volume并校正時間。

重現性差：再平衡不足、泵脈動、溫度波動或樣品吸附。

優化策略（實用步驟）

用標準混合物做快速線性梯度掃描（不同起始/終止/時間）觀察分離窗口與峰容量。

若早期峰擁擠，可降低起始%B或增加前段流速/等度延長；若晚期峰保留過強，可加快梯度后半段或提高終點%B。

逐步細化：先粗調（時間尺度與%范圍），再微調（斜率、中間階躍、沖洗時間）。